Клонирање гена је чин стварања копија или клона јединственог гена. Када се идентификује ген, клонови се могу користити у многим областима биомедицинских и индустријских истраживања. Генетички инжењеринг је процес клонирања гена у нове организме или промена секвенце ДНК да би се промијенио протеин производ. Генетски инжењеринг зависи од наше способности да извршимо следеће битне процедуре.
01 Реакција ланца полимеразе
02 Ограничења ензима
Откриће ензима познатих као рестриктивне ендонуклеазе је суштинско за инжењеринг протеина . Ови ензими су резали ДНК на одређеним локацијама на основу нуклеотидне секвенце. Стотине различитих ензима рестрикције , способних за резање ДНК на различитим местима, изоловане су од многих различитих врста бактерија. ДНК резана са рестрикционим ензимом производи много мањих фрагмената различитих величина. Ове могу бити одвојене помоћу електрофорезе гела или хроматографије.
03 Електрофореза
Прочишћавање ДНК из ћелијске културе или његово резање помоћу ензима рестрикције не би било од велике користи ако не би могли да визуелизујемо ДНК - тј. Пронаћи начин да видите да ли ваш екстракт садржи било шта, или у којој мери вам фрагментира Прешао сам. Један од начина за то је гел електрофореза. Гелови се користе у различите сврхе, од гледања резане ДНК до детекције ДНК уметака и ноктију.
04 Придружите се двема комадима ДНК
У генетском истраживању, често је неопходно повезати две или више појединачних ћелија ДНК-а, да би се створио рекомбинантни део или затвори кружну жицу која је исечена рестрикционим ензимима. Ензими звани ДНК лигазе могу створити ковалентне везе између нуклеотидних ланаца. Ензими ДНК полимераза И и полинуклеотидна киназа такође су важни у овом процесу, за попуњавање празнина или фосфорилацију 5 'крајева, респективно.
05 Избор мале самореактивне ДНК
Мали кружни делови ДНК који нису део бактеријског генома, али су способни за самоприљавање, познати су као плазмиди. Плазмиди се често користе као вектори за транспорт гена између микроорганизама. У биотехнологији, када је ген који је интересантан амплификован, а гени и плазмид се пресецају са ензима рестрикције, они се лигирају заједно генеришући оно што је познато као рекомбинантна ДНК. Вирусна (бактериофагна) ДНК се такође може користити као вектор, као и космиди, рекомбинантни плазмиди који садрже гене бактериофага.
06 Метода за померање вектора у ћелију домаћина
Процес преноса генетског материјала на вектор као што је плазмид, у нове ћелије домаћина назива се трансформација. Ова техника захтева да ћелије домаћина буду изложене промени у околини што их чини "компетентним" или привремено пропустљивим за вектор. Електропорација је једна таква техника. Што је већи плазмид, то је нижа ефикасност коју узимају ћелије. Већи ДНК сегменти се лакше клонирају помоћу бактериофага, ретровируса или других вирусних вектора или космида у поступку који се назива трансдукција. Пхаге или вирусни вектори се често користе у регенеративној медицини, али могу изазвати уношење ДНК у делове наших хромозома тамо где то не желимо, узрокујући компликације и чак рак.
07 Методе избора трансгених организама
Нису све ћелије преузеле ДНК током трансформације. Од суштинског је значаја да постоји начин откривања оних који раде. Генерално, плазмиди носе гене за отпорност на антибиотике, а трансгене ћелије могу бити одабране на основу експресије тих гена и њихове способности да расте на медијима који садрже тај антибиотик. Алтернативне методе селекције зависе од присуства других репортер протеина као што су к-гал / лацЗ систем или зелени флуоресцентни протеин, који омогућавају селекцију засновану на боји и флуоресценцији, респективно.