Шта ПЦР има да ради са ДНК секвенцирањем и амплификовањем гена
Полимеразна ланчана реакција ( ПЦР ) је молекуларна генетска техника за прављење вишеструких копија гена и такође је део процеса секвенционирања гена.
Како функционира реакција ланца полимеразе?
Копије гена се израђују помоћу узорка ДНК, а технологија је довољно добра да направи више копија из једне копије гена која се налази у узорку. ПЦР амплификација гена ради милион копија, омогућава откривање и идентификацију генских секвенци користећи визуелне технике засноване на величини и пуњењу (+ или -) комада ДНК.
У контролисаним условима, мали сегменти ДНК генеришу ензими познати као ДНК полимеразе, који додају комплементарне деоксинуклеотиде (дНТПс) на део ДНК познат као "шаблон". Чак и мањи дијелови ДНК, звани "прајмери", користе се као полазна тачка за полимеразу. Подлоге су мали уметнички комадићи ДНК (олигомери), обично између 15 и 30 нуклеотида. Направљени су познавањем или угрожавањем кратких ДНК секвенци на самим крајевима гена који се појачавају. Током ПЦР-а, ДНК која се секвенцира загрева се и двоструке прамене одвајају. По хлађењу, прајмери се везују за шаблон (назван аннеалинг) и креирају место за полимеразу.
ПЦР техника
Полимеразна ланчана реакција (ПЦР) омогућена је открићем термофила и термофилних полимеразних ензима (ензими који одржавају структурални интегритет и функционалност након загревања на високим температурама).
Кораци укључени у ПЦР технику су следећи:
- Створена је смеша са оптимизованим концентрацијама ДНК шаблона, ензима полимеразе, прајмера и дНТП. Способност загревања смеше без денатурирања ензима омогућава денатурирање двоструке спирале узорка ДНК на температурама у распону од 94 степени Целзијуса.
- Након денатурације, узорак се охлади на умјеренији опсег, око 54 степени, што олакшава одрезивање (везивање) прајмера на једнострану ДНК шаблоне.
- У трећем кораку циклуса, узорак се поново загрева до 72 степени, идеална температура за Так ДНК полимеразу, за издужење. Током издужења, ДНК полимераза користи првобитну јединицу ДНК као шаблон за додавање комплементарних дНТП-а на 3 'крајеве сваког прајмера и генерише део двоструке ДНА у региону генског интереса.
- Примере које су жариле до ДНК секвенце које нису тачна подударност не остану жарени на 72 степени, па ограничавају истезање на ген који је од интереса.
Овај процес денатурирања, жарења и издужења се понавља вишеструким (30-40) пута, чиме експонентно повећава број копија жељеног гена у смеши. Иако би овај процес био прилично досадан ако би се извршио ручно, узорци се могу припремати и инкубирати у програмабилном Тхермоцицлер, који је сада уобичајен у већини молекуларних лабораторија, а потпуна ПЦР реакција може се обавити за 3-4 сата.
Сваки денатурни корак зауставља процес елонгације претходног циклуса, чиме се скраћује нова дужина ДНК и задржава га приближно на величини жељеног гена.
Трајање циклуса продужења може бити дуже или краће у зависности од величине генског интереса, али на крају, кроз поновљене циклусе ПЦР-а, већина шаблона ће бити ограничена само на величину гена од интереса, јер биће произведени од производа оба прајмера.
Постоји неколико различитих фактора за успешан ПЦР који се може манипулисати како би се побољшали резултати. Најчешће коришћена метода за тестирање присуства ПЦР производа је електрофореза агарозног гела . Који се користи за одвајање фрагмената ДНК заснованих на величини и наплати. Фракције се затим визуализују помоћу боја или радиоизотопа.
Еволуција
Од откривања ПЦР-а, пронађене су ДНК полимеразе које нису оригинални Так. Неке од њих имају бољу способност "коректуре" или су стабилније на вишим температурама, чиме се побољшава специфичност ПЦР-а и смањује грешке приликом убацивања нетачног дНТП-а.
Неке варијације ПЦР-а су дизајниране за специфичне примјене и сада се редовно користе у молекуларним генетским лабораторијама. Неке од њих су ПЦР ПЦР и Реверсе-Трансцриптасе ПЦР у реалном времену. Откриће ПЦР-а такође доводи до развоја секвенцирања ДНК, отиска прстију ДНА и других молекуларних техника.