Прилагођавање било којој од компоненти реакције ланца полимеразе (ПЦР) може промијенити квалитет исхода, било побољшањем или смањењем приноса и квалитета производа или побољшањем специфичности реакције и осјетљивости. Параметри који утичу на крајњи резултат могу бити физички (тј. Температура, време циклуса) или хемијска (тј. Концентрација шаблона, врста коришћеног ензима). Следећи су неколико кључних фактора који утичу на успех ПЦР-а.
01 Чисти лабораторијски услови
Пошто је ПЦР способан да детектује један молекул ДНК, важно је одржавати непрецизне услове у лабораторији. Увијек носите свјеже рукавице, користите стерилну посуду од стакла, цијеви и пипете и стерилна рјешења и очистите радно подручје прије почетка рада.
Увек укључите контролне реакције, без ДНК и без ензима, како би се осигурало да су резултати стварно захваљујући појачању правог узорка.
Већина људи се побринула да поседује сопствени скуп решења који се не деле за лакше решавање проблема и одређене пипете често се издвајају само за ПЦР. ПЦР цеви без ДНасе и РНасе, савјети за пипете са отпорним на аеросол и рад на удубљењу са УВ зрачењем су такође начини да се проблеми умањују.
02 Хемијска компонента
- Имајте 18 до 24 базе
- Немамо секундарну структуру (нпр. Петље за шишмиш)
- Имајте уравнотежену расподелу Г / Ц и А / Т парова
- Нису комплементарни једни на друге на крајевима од три стопе
- Температуре топљења (Тм) око 5-10 степени Целзија испод температуре жарења, која је обично између 55 и 65 степени Целзија
Тм за оба прајмера такође треба да буде сличан за најбоље резултате.
03 Реакциона мешавина: Шаблон и прајмери
Оптималне концентрације прајмера су између 0,1 и 0,6 микромола / л. Количина шаблона варира у зависности од врсте ДНК (људског, бактеријског, плазмида).
Уз врло ниске количине предложака, постоје и друге стратегије за побољшање резултата, као што су повећани бројеви циклуса или употреба "врућег старта". Увек тестирајте нове прајмере са позитивном контролном реакцијом, како бисте били сигурни да раде под вашим специфичним експерименталним условима.
04 Реакциона мешавина: активност ензима
Концентрација МгЦл2 у реакционој мешавини може да утиче на исход ПЦР-а и може играти важну улогу у хитнијим реакцијама. Магнезијум катион обликује растворљиве комплексе са дНТПс да би произвела стварни субстрат који препознаје полимеразни ензим.
Једнаке количине свих четири дНТП-а такође помажу у смањењу стопе грешке полимеразе. Одређени адитиви као што су бетаин, БСА, детерџенти, ДМСО, глицерол и пирофосфатаза такође могу утицати на специфичност ензима или ефикасност реакције.
05 Тип термоцикла
Када купујете лабораторијску опрему, имајте на уму да су неки термоцикли мање прецизнији од других при одржавању тачних, жељених температура.
Ово је једно подручје гдје се јефтино неће дуго исплатити када се суочите с финицком реакцијом или примјеном прајмера који захтијевају уски распон температуре за жарење.
Реакционе цеви танких зидова дизајниране да одговарају тачним маркама термоциклера који користите, такођер помажу у оптимизацији температура реакције.
06 Поставке циклуса
Повећање приноса се може постићи повећањем времена продужења око сваких 20 циклуса, како би се компензовао мањи ензим да би се појачало више шаблона. Обично је мање од 40 циклуса довољно за амплификацију мање од 10 молекула темплера на довољно концентрацију да би се видела на гелу обојеног са етидијум бромидом.