Степен потребног чистоће протеина зависи од намераване крајње употребе протеина.
За неке примјене довољан је суров екстракт. Међутим, за друге намене, као што су храна и фармацеутски производи, неопходан је висок ниво чистоће. Да би се постигло ово, обично се користе неке методе пречишћавања протеина, у низу корака пречишћавања.
Сваки корак пречишћавања протеина обично доводи до неког степена губитка производа. Дакле, идеална стратегија пречишћавања протеина је она у којој се постиже највећи ниво пречишћавања у најмањим корацима. Одабир корака које треба користити зависи од величине, набојке, растворљивости и других својстава циљног протеина. Следеће технике су најпогодније за пречишћавање једног цитостолног протеина. Пречишћавање комплекса цитосолних протеина је компликованије и обично захтијева примјену различитих метода.
Први кораци за пречишћавање протеина
Први корак у пречишћавању интрацелуларних (унутар ћелијских) протеина је припрема сировог екстракта .
Екстракт ће садржати сложену мешавину свих протеина из ћелијске цитоплазме и неке додатне макромолекуле, кофакторе и хранљиве материје. Сирови екстракт се може користити за неке примене у биотехнологији, међутим, ако је чистоћа проблем, следећи кораци пречишћавања морају се пратити.
Сирови протеински екстракти се припремају уклањањем ћелијских остатака насталих лизом ћелија, што се постиже коришћењем хемикалија и ензима , ултразвуком или француским штампом. Обрт се уклања центрифугирањем, а супернатант се опоравља. Сирове препарате екстрацелуларних протеина могу се добити једноставним уклањањем ћелија центрифугирањем.
За одређене примене у биотехнологији постоји потреба за термостабилним ензимима : Ензими који могу толерисати високе температуре без денатурирања и уз одржавање високе специфичне активности. Организми који их производе понекад називају екстремофили. Једноставан приступ пречишћавању протеина отпорног на топлоту је да се денатурира друге протеине у смеши загревањем, а затим хлађење раствора (омогућавајући тако да се термостабилни ензим реформише или поново отопи, ако је потребно. Денатурирани протеини се затим могу уклонити центрифугирањем.
Степени прочишћавања пречишћавања
У прошлости, заједнички други корак за пречишћавање протеина из сировог екстракта био је преципитацијом у раствору са високом осмотском јачином (нпр. Соли). Нуклеинске киселине у сировом екстракту могу се уклонити преципитацијом агрегата формираних стрептомицин сулфатом или протамин сулфатом.
Преципитација протеина се обично врши помоћу амонијум сулфата као соли.
Различити протеини ће преципитирати у различитим концентрацијама амонијум сулфата . Генерално, протеини са вишом молекулском тежином преципитирају у нижим концентрацијама амонијум сулфата. Падавина соли обично не доводи до високо пречишћеног протеина, али може помоћи у уклањању неких нежељених протеина у смеши и концентрирању узорка. Соли у раствору се затим уклањају путем дијализе кроз порозну целулозну цевчицу, филтрацију или гелску искључивну хроматографију.
Савремени биотехнолошки протоколи често искоришћавају многе комерцијалне доступне комплете који пружају готова решења за стандардне процедуре. Чишћење протеина се често изводи помоћу филтера и припремљених колутова за гелску филтрацију. Све што треба да урадите јесте да пратите упутства и додате праву запремину одговарајућег решења и сачекајте одређено време док сакупљате елуент (шта излази на другом крају колоне) у свежу епрувету.
- Хроматографске методе се могу применити помоћу стубова са горњим слојем или аутоматизованом ХПЛЦ опремом. Сепарација помоћу ХПЛЦ-а може се вршити помоћу реверзне фазе, методе размене јона или мјерења величине и узорака детектованих помоћу диоде или ласерске технологије. -
Визуализација протеина и процена пречишћавања
- Хроматографија са реверзном фазом (РПЦ) раздваја протеине на бази релативне хидрофобности . Ова техника је високо селективна, али захтева употребу органских растварача. Неки протеини трајно су денатурирани растварачима и изгубит ће функционалност током РПЦ-а. Због тога се ова метода не препоручује за све апликације, нарочито ако је неопходно да циљани протеин задржи активност.
- Јонска хроматографија се односи на одвајање протеина на бази пуњења . Колоне могу бити припремљене за размјену ањона или размјену катиона. Колоне за размену аниона садрже стационарну фазу са позитивним пуњењем која привлачи негативно напуњене протеине. Колоне за размјену катиона су обрнути, негативно набијени перли који привлаче позитивно напуњене протеине. Елуција циљних протеина се врши променом пХ у колони, што резултира промјеном или неутрализацијом заручених функционалних група сваког протеина.
- Хроматографија величине искључивања ( гелова филтрација ) одваја веће протеине од малих, пошто већи молекули путују брже кроз укрштени полимер у колони хроматографије. Велики протеини се не уклапају у пореове полимера, док мање протеине раде и трају дуже да пролазе кроз хроматографску колону преко мање директне руте. Елуат се сакупља у низу цеви које раздвајају протеине на бази времена елуције. Филтрација гела је корисно средство за концентрацију узорка протеина јер се циљни протеин сакупља у мањој волумени елуирања него што је иницијално додато у колону. Сличне технике филтрације могу се користити током производње великих протеина због њихове економичности.
- Афинитетна хроматографија је веома корисна техника за "полирање" или довршавање процеса пречишћавања протеина. Куглице у хроматографској колони су укрштене на лиганде који се специфично везују за циљни протеин. Протеин се затим уклања из колоне испирањем раствора који садржи слободне лиганде. Овај метод даје најчистије резултате и највишу специфичну активност у поређењу са другим техникама.
- СДС-ПАГЕ је полиакриламидна гел електрофореза, изведена у присуству СДС (натријум додецил сулфата) који се везује за протеине дајући им велики негативни негативни набој. Пошто су цене свих протеина прилично једнаке, ова метода их раздваја готово у потпуности засноване на величини. СДС-ПАГЕ се често користи за тестирање чистоће протеина након сваког корака у низу. Како се нежељени протеини постепено уклањају из смеше, смањен је број трака који су визуелизовани на СДС-ПАГЕ гелу, док не постоји само један опсег који представља жељени протеин.
- Имуноблотирање је техника визуелизације протеина примењена у комбинацији са афинитетном хроматографијом. Антитела за одређени протеин се користе као лиганди на колони афинитетне хроматографије. Циљни протеин се задржава на колони, а затим уклања испирањем колоне раствором соли или другим агенсима. Антибодије повезане са радиоактивним или етикетама за бојење помажу у детекцији циљане протеине када се одвоји од остатка мешавине.
Извори:
Зубаи Г. 1988. Биоцхемистри, 2нд Едитион. Мацмиллан Публисхинг Цо., Њујорк, САД, САД.
Амерсхам Пхармациа Биотецх. 1999. Приручник за пречишћавање протеина, издање АБ. Амерсхам Пхармациа Биотецх Инц. Нев Јерсеи, САД. хттп://ввв.биоцхем.уиова.еду/донелсон/Датабасе%20итемс/протеин_пурифицатион_хандбоок.пдф.